附录2 人凝血因子Ⅷ效价测定(二步法)

1 材料

1.1试剂

1.1.10.05mol/L CaCl2溶液

称7.35gCaCl2·2H2O(分析纯),加蒸馏水溶解,稀释至1000ml。

1.1.20.025mol/L CaCl2溶液

称3.675gCaCl2·2H2O(分析纯),加蒸馏水溶解,稀释至1000ml。

1.1.3 咪唑缓冲液

称0.68g咪唑和1.17gNaCl,溶于约100ml蒸馏水中,加37.2ml0.1mol/l HCl,加蒸馏水至200ml,pH为7.3~7.4。

1.1.4 枸橼酸盐-氯化钠溶液

1份3.8%枸橼酸三钠溶液加5份0.85%NaCl溶液混匀。

1.1.5Al(OH)3胶

a称(NH4)2SO45.5g,溶于150ml63℃蒸馏水中。

B称氨明矾19.175g,溶于250ml58℃的蒸馏水中。

C最取12.5ml氨水(比重0.88),加12.5ml蒸馏水。

三种溶液配毕后,立即将c液迅速倒入a液中搅匀,然后在搅拌下将此混合液迅速倒入b液,用力搅拌10分钟(保持温度不低于58℃),离心(2500r/min,15分钟),弃上清,沉淀洗涤5次。

第一次:用75ml蒸馏水加0.055ml氨水(比重0.88)混匀,离心,弃上清。

第二次:用75ml蒸馏水加0.11ml氨水(比重0.88)混匀,离心,弃上清。

第三、四、五次分别用75ml蒸馏水洗。

将沉淀物悬浮于总体积为175ml蒸馏水中,混匀,分装,4℃保存。

1.1.6 正常人血清

分别收集20份以上正常人血于干燥灭菌的玻璃瓶中,待血凝固后,放于37℃保温5~6小时,置4℃冰箱过液,分离血清,混匀,定量分装(0.5ml/安瓿),冷冻干燥,-20℃保存。

用时,取冻干品1支,按标示量加蒸馏水溶解,然后用咪唑缓冲液作1∶10稀释,4℃冰箱过夜(使血清活化),试验当日再用咪唑缓冲液作最适浓度稀释(一般为1∶20),置冰浴备用。

1.1.7 牛Ⅴ因子

收集公牛血于干燥灭菌的玻璃容器中,室温放置4小时,离心(2500r/min,30分钟),分离血清,取血清加10%(g/ml)BaSO4在室温下搅拌吸附40分钟,离心(2500r/min,40分钟),弃沉淀,定量(1ml/瓶)分装,冷冻干燥,-20℃保存。

用时取冻干品1支,按标示量加蒸馏水溶解,用生理盐水作最适浓度稀释(一般为1∶20),置冰浴备用。

1.1.8 磷脂

取新鲜脑(人,牛,兔),除去表面血管、脑膜,尽可能除去白质,切成薄片,称重,轻轻捣碎,用3倍脑组织的丙酮提取5次,每次用双层绸布滤干,最后脑粉于37℃干燥1小时,称取脑粉1g,加20ml氯仿提取,于室温振摇2小时后,用单层滤纸过滤,滤液放抽气柜内用吹内机吹至微干,加10ml生理盐水研制成白色均匀乳状液,定量(0.1ml/瓶)分装,冷冻干燥,-20℃保存。

用时,取冻干品1支,按标示量加蒸馏水溶解后,用盐水作最适浓度稀释(一般为1∶100~1∶500),置冰浴备用。

1.1.9 基质血浆

正常枸橼酸血浆,按3ml分装,-20℃保存。

1.2标准品和样品。

2 操作

2.1试剂混合

取稀释人血清、Ⅴ因子、磷脂等量混合,置冰浴30分钟后备用。

2.2标准品、样品的准备和稀释

2.2.1 若试验血浆对标准血装(标准血浆为未吸附者):二者按1ml血浆加0.1ml Al(OH)3悬浮液混合,置37℃水浴吸附3分钟,离心取上清备用。

2.2.2 试验血浆对浓缩标准或试验浓制品对标准血浆:用Ⅷ因子严重缺乏的血浆(Ⅷ因子含量<1%)稀释浓缩标准品或试验浓制品使成0.5~1.0IU/ml,然后按2.2.1法进行吸附处理。

2.2.3浓缩试验品对浓缩标准品:直接溶解稀释成0.5~1.0IU/ml。

2.2.4标准品和检品准备好后,立即用枸橼酸盐一氯化钠溶液分别作3个连续倍倍稀释,使最低和最高稀释度的凝结时间在17~35秒间(一般为1∶16~1∶256)

2.3 测定

2.3.1 第一步,混合物的保温

取7支玻璃凝集管放入冰浴中,每管加0.3ml混合试剂,然后于第1、2、3管分别加高、中、低稀释度的标准品各0.1ml,第4、5、6管分别加高、中、低稀释度的样品各0.1ml,第7管加枸橼酸盐-氯化钠溶液0.1ml(作空白);从第1管开始逐管移入37℃水浴,加0.05mol /L预温CaCl2溶液0.1ml,混匀,记时。每管移入37℃水浴及加CaCl2溶液的时间间隔均为1分钟。

2.3.2 第二步,凝血酶原激活物生成量的测定(取样时间以15分钟和21分钟为例)

另取13支凝集管,每管各加入0.025mol/l CaCl2溶液0.2ml,当第一步第1管保温至12分钟时,将此13支凝集管和1支装有基质血浆的试管放入37℃水浴中,待混合物保温至14分钟40秒时,从第1保温管中取出0.1ml混合物加到1支含有0.025mol/l CaCl2溶液的凝集管中,于15分钟时,加入0.2ml基质血浆混匀,另用一只秒表记录从基质血浆加入到纤维蛋白形成所需的时间(纤维蛋白形成可用肉眼观察,也可用仪器测量),其余各管每隔1分钟如此依次进行,并于第21~26分钟作第二系列测定,两系列所测得凝结时间不应相差5%(说明稳定的凝血酶原激活物已形成,否则保温时间应调整)。空白管于第27分钟时取样测定。

为了消除试验顺序误差,将标准品和样品的试验顺序改变,2.3.1及2.3.2项过程重复一次。

2.4 计算

2.4.1 作图法

用双对数纸,以凝结时间(秒)为纵坐标,稀释度(如25%、50%、100%……)为横坐标,分别将标准品和样品两套试验结果的平均凝结时间作两条平行线,从100%含量的稀释度处作一垂直线与试验线相交,通过交点作一水平线与标准线相交,再通过交点作一垂直线与横坐标相交,其交点读数即为试验样品相当于标准品的百分含量。若标准线和试验线的直线性、平行关系有显著性差异,或空白试验小于40秒,则分析结果无效。

2.4.2 用3.3平行线法公式计算

样品效价(IU/ml)=log-1(I·V/W)标准品效价·样品稀释倍数×D值

I=0.301(2倍系列稀释法的常数)

V=1/3(T1+T2+T3-S1―S2―S3)

T1、T2、T3为样品3个倍倍稀释度的凝固时间(秒)

S1、S2、S3为标准品3个倍倍稀释度的凝固时间(秒)

若V为负值,变为正值后再代入上面公式计算,若V为正值,变成负值后再代入上面公式计算。

W=1/4(T3-T1+S3-T1)

D值=标准品的最大稀释度/样品的最大稀释度

3 注意事项

3.1因Ⅷ因子易变不稳定,因此在进行标准品和样品的稀释时,应快而准确,稀释后立即检定,冰浴中不得放置30分钟以上。

3.2试验中各试剂的最适稀释度和混合物保温时间随试剂的变化而异,故应作试验预测,稀释试剂应在冰浴中放置,使用时间超过半天应重新配制。

《中国生物制品规程》