第四节 非酯化脂肪酸测定

临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)或非酯化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid,NFFA),正常血清中含有油酸(18:1,W9)占54%,软脂酸(16:0)占34%,硬脂酸(18:0)占6%,是其主要的NFFA。另外还有月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)和花生四烯酸(20:4,W6,9,12,15)等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较,NFFA在血中浓度很低,其含量水平极易受脂代谢,糖代谢和内分泌机能等因素影响,血中NFFA半寿期为1~2min,极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输,属于一种极简单的脂蛋白。

测定血清NFFA法有滴定法。比色法,原子分光光度法,高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在,极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内,若保存三天,其值约升高30%,使结果不准确。

1.非酶法测定

非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差;高压液相层析法,仪器太昂贵,不便于批量操作。

2.酶测定法

主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A(CoA)进行定量。酶法测定结果准确可靠,快速,易于批量检测。测定原理如图15-6所示。

血清主要FFA酶法测定图

图15-6 血清主要FFA酶法测定图

□:内物质作为生成量与变化量进行测定;ACS:乙酰CoA合成酶;MK:肌激酶; PK:丙酮酸激酶;POD:丙酮酸氧化酶;DTNB:α-磺基苯甲酸;ACO:乙酰CoA氧化酶;ACD:乙酰CoA脱氢酶。

一、亮度法

1.原理

血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中,形成铜皂在上层溶剂中,再用二苯卡巴肼与铜显色,进行定量。

2.试剂组成

代号种类浓度组成贮存2~8℃有效期
R-1抽提剂 氯仿:庚烷:甲醇=5:5:1(V/V)  
R-2缓冲液33mmol/LKH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l 50ml调pH至6.4  
R-3铜贮液500mmol/LCu(NO32·3H2o 12.07g加H2O→100ml  
R-4三乙醇胺1.0mol/L三乙醇胺10ml,加水→100ml  
R-5NaOH液1mol/L   
R-6铜试剂 R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml

+H2O→100ml调pH至8.1

  
R-7二苯卡

巴肼液

 二苯卡巴肼(乙醇)液(4g/L)10ml+R-4 0.1ml 临用前配制
R-8软脂酸标准贮存液2mmol/L软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液冷藏 
R-9R-8的应用液500μmol/L用R-1液稀释冷藏 

3.操作

按图15-7操作。

4.计算

血清游离脂肪酸(μmol/L)=ESA/EST×500

二、酶法

1.原理

血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA),经酶试剂作用生成紫色化合物,其颜色深浅与NEFA含量成正比。

二、酶法

2.试剂组成

代号种类组成浓度贮存贮存
R1缓冲液磷酸缓冲液

MgCl2

去垢剂

0.04mmol/LpH6.9

3mol/L

 
R2酶/辅酶乙酰CoA合成酶

抗坏血酸氧化酶

CoA

ATP

4-AAP

溶于10ml R1液中

≥0.3U/ml

≥1.5U/ml

0.9mmol/L

5.0mmol/L

1.5mmol/L

冷藏5日
R3酶稀释液苯氧乙醇

去垢剂

0.3%(V/V) 
R4 马来酰亚胺

该试剂与R3等体积混合

10.6mmol/L 
R5酶试剂乙酰CoA氧化酶

过氧化物酶

TOOS

混合上述试剂,再等体积R4试剂混合

≥10U/ml

7.5U/ml

0.2mmol/L

冷藏5日
R6标准液 1mmol/L冷藏

*应用带玻塞离心管

3.操作

按图15-8操作。

4.计算

血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图

血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图

图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图

血清非脂化脂肪酸测定(酶法)操作图

图15-8 血清非脂化脂肪酸测定(酶法)操作图

(胡汉宁 储建中)

《动脉粥样硬化》