第一章 一般性操作技术

第一节　血液标本的采集和处理

血液标本的采集是分析前质量控制的重在环节，可分为毛细血管采血法和静脉采血法。需要血量较少的检验，如手工法或半自动血细胞分析仪血细胞计数，常用毛细管采血法。需血量较多检验，如红细胞比积、临床生化检验、全自动血细胞分析血细胞计数一般用静脉采血法。特别是全自动血细胞分析仪，无论仪器进样品多少，为防止血样中小凝块的形成，保证仪器进样时标本能充分混匀，原则上均应使用静脉血。毛细血管血和静脉血之间，无论细胞成分或化学组成，都存在程度不同的差异。在判断和比较所得结果时必须予以考虑。

某些生理因素，如吸烟、进食、运动和情绪激支等，均可影响血液成分。甚至一日之间，白细胞总数、嗜酸性粒细胞绝对值、淋巴细胞各亚群的比例等参数均有一定的波动。服用某些药物可能明显干扰实验，得出假象结果。因此采血时，应询问浊否服用过明显干扰试验的药物（如阿司匹林对血小板聚集的抑制作用）关尽可能在一定时间在避免干扰因素条件下进行，以便于比较和动态分析。

一、毛细血管采血法

成人常用手指或耳垂采血。耳垂采血痛较轻，操作方便，适用于肥复采集，特别是手指皮肤粗厚者，但耳垂外周血循环较差，血细胞容易停滞，受气温影响较大，检查结果不够恒定。红细胞、白细胞、血红蛋白和红细胞比积结果均比静脉血高，特别是冬季小波动幅度更大。手指采血操作方便。可获较多血量。婴幼儿手指太小可用拇指或足跟采血。严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血，采血器以用带带三棱针或专用的“采血针”为好，特别是后者有利于采血技术的质量控制，为了避免交叉应严格实行一人一针制。应注意穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组织液，影响检验结果。

二、静脉采血法

几位于体表的浅静脉均可作为采血部位，通常采用肘部静脉，肘部静脉不明显时，可用手背静脉或内踝静脉。幼儿可于颈外静脉采血。根据采血量可选用不同型号注射器配血相应的针头。某些特殊的检查，比台血小板的激活，要使用塑料注射器和硅化处理后的试管或塑料闭幕式管。采血前应向病人作适当解释，以消除不必要的疑虑和恐惧。如遇个别病人采血后发生晕厥，可让其平卧，通常休息片刻即可恢复。必要时可嗅芳香氨酊，针刺或指掐人中，合谷等穴位。止血带压迫时间不难过长，归好不超过半分钟，以避免瘀血和血液浓缩，有试验证明，压迫时间过长，可引起纤溶活性增强，血小板释放及甘些因子活性增强，影响某些实验结果。注射器和容器必须干燥，抽血时避免产生大量泡沫，向血后应先拔针头，然后将血液徐徐注入标本容器。否则可能导致溶血。溶血标本不仅红细胞半数，红细胞比积降低，血浆清化学组成也会产生变化，影响钾、镁、转氨酶等多项指标的测定。有些试验需用具有严密寒紧的，洁净的橡胶或塑料寒子的玻璃或塑料管作采血及储存器。目前国外已经普及（国内已开始生产）的封闭式真空采血器，既有利于标本的收集运送和保存，又便于防止血液交叉感染，已开始在国内推广使用。

血液标本的保存条件非常重要，不适当保存直接影响实验结果。文献报导，既便将血浆放在4。C冰箱内保存，24小时后的因子活性也仅为采血后即刻实验结果的5%（减少95%），而供血液分析仪进行细胞计数的血液只能在室温下保存，低温保存可使血小板计数结果减低。因此，应根据实验项止确定最佳的保存条件。

三、抗凝剂

抗凝剂种类很多，性质各异，必须根据检验止的适当选择，才能获得预期的结果。现将实验常用抗凝剂及其使用方法简述如下：

1、乙二胺四乙酸（EDTA）盐 EDTA有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子结全成螯合物，从而阻止血液凝固。

Na₂C₁₀H₁₄O₈N₂+C_A²⁺→C_AC₁₀H₁₂O₈N₂+2N_A⁺+2H⁺

EDTA盐经100⁰C烘干，抗凝作用不变，通常配成15g/L水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。EDTA盐对红、白细胞形态影响很小，根据国际血液学标准公委员会（International committee standard of hematology ,ICSH）1993年文件建议，血细胞计数用EDTA二钾作抗凝剂，用量为EDTA-K2。2H2O1.5-2.2Mg （4.45±0.85μmol）/ml血液。EDTA-NA与EDTA-K2对血细胞计数影响均较小，但二钠溶解度明显低于二钾，有时影响抗凝效果，其他抗凝剂不适合于血细胞计数。表1-1是几种抗凝剂对白细胞计数的影响，EDTA影响小板聚集，不适合于作凝血象检查和血小板功能试验。

表1-1 不同抗凝剂不同条件保存血液的WBC变化（×10⁹/L）

2.枸椽酸钠（trisodiumcitrate）枸椽酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固。

2N_a3C₆H₅O₇+2C_A²⁺→2C_AC₆H₅O₇^-+6N_a⁺

枸椽酸钠有2Na₃C₆H5_O7。和2N_a3C₆H_5。11H₂O等多种晶体。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用，使其活性减低缓，故常用于凝血象的检查，也用于红细胞沉降率的测定。因毒性小，是输积压保养中的成分之一。

由于枸椽酸钠溶液是按体积肥比例加入血液内达到抗凝目的的，而抗凝剂主要是作用于积压浆成分，通常所谓的1：9比例抗凝的概念是提1份体积的抗凝剂作用9份红细胞比积正常血液内的血浆成分而言。所以台果对贫血或红细胞增多症患者的血液仍按1：9的比例加入抗凝剂时，就会发生抗凝剂足或相对过多，这将明显地影响凝象检查结果。为了避免这种现象，有文献报道应根据抗凝剂用量（ml）=0.00185×血量×（100—病人红细胞比积%）这一公式，来计算抗凝剂的用量。

3．草酸钠（sodiumoxalate）草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。

草酸钠通常用0.1mol/L浓度，与血液按1：9比例使用，过去主要用于凝务象检查。实践发现草酸盐对凝备V因子保护功能差，影响凝血酶原时间测定效果；另外由于草酸盐与钙结合形成的是沉淀物，影响自动凝血仪的使用，因此，多数学者认为凝积压象检查选用枸椽酸钠为抗凝剂更为适宜。

4．肝素（heparin）肝素广泛在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和暑碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，是分散物质，平均分子量为15000（2000-40000）。肝素可加强抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶形成，对抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用。每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu 。尽管肝素可以保持红细胞的自然形态，但由于其常可引起白细胞聚集关使用涂片在罗氏（）染色时产生蓝色背景，因此肝素抗凝血不适全血液学一般检查。肝素是红细胞透渗脆性试验理想的抗凝剂。

第二节　血涂片的制备和细胞染色

血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。比台观察10个高倍视野血涂片中白细胞和血小板数大致估计血内这些细胞的数量，借以作为仪器结果分析后质控的参考。

但积压涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，细胞分布不匀；染色偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常。因皮制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液学检查的重要革本技术之一。

血涂片制备方法及注意事项将在实习指导中详细介绍。

1．瑞特（Wright）染色法：为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。

（1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。

（2）细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

（3）PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。EAm GILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。rA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl（视染液浓度而定），加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm ;天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。所以新配染料rA接近2，随着美蓝逐渐氧化为天青B，RA也相应下降。RA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞特染液贮存过程中，必须塞严，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，关可合细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。

2．吉姆萨（Giemsa）染色法：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。