补体结合试验(complementfixationtest,CFT)是用免疫溶血机制做指示系统,来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断,即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进,除了用于传染病诊断和流行病学调查以外,在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。
一、类型及原理
该试验中有5种成分参与反应,分属于3个系统:①反应系统,即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原);②补体系统;③指示系统,即SRBC与相应溶血素,试验时常将其预先结合在一起,形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统,先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
如果反应系统中存在待测的抗体(或抗原),则抗原抗体发生反应后可结合补体;再加入指示系统时,由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血,是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体(或抗原),则在液体中仍有游离的补体存在,当加入指示系统时会出现溶血,是为补体结合试验阴性(图14-2)。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体,或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图
二、试验方法
补体结合试验的改良方法较多,较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法(塑板法)等。目前以后两种方法应用较为广泛,因为可以节省抗原,血清标本用量较少,特异性也较好。以下叙述以小量法为例,即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml,补体加0.2ml,总量为0.6ml。
(一)试剂
1.抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯,纯度愈高,特异性愈强。如使用粗制抗原时,须经同样处理的正常组织作抗原对照,以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2.抗原和抗本的滴定补体结合试验中,抗原与抗体按一定比例结合,因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定,选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应(100%不溶血)的最高稀释度作为抗原和抗体的效价(单价)。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原,配加不同稀释度的抗血清,另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统,温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中,抗原一般采用2~4个单位(1:64~1:32),抗体采用4个单位(1:8)。
表14-4抗原和抗体的方阵滴定
抗原 | 抗血清稀释倍数 | 抗原对照 | |||||||
1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | ||
1:4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 0 |
1:8 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 1 | 0 |
1:16 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 2 | ± | 0 |
1:32 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 1 | ± | 0 | 0 |
1:64 | 4 | 4 | 4 | ④ | 2 | ± | 0 | 0 | 0 |
1:128 | 4 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
1:256 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
1:512 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
抗体对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
注:1、2、3、4分别表示溶血反应强度+、++、+++、++++;0为不溶血。
3.补体滴定按表14-5逐步加入各试剂,温育后观察最少量补体能产生完全溶血者,确定为1个实用单位,正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血,按比例公式0.12×2:60=0.2:X计算,X=50;即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。
表14-5补体的滴定
管号 | 1:60补体(ml) | 缓冲液(ml) | 稀释抗原(ml) | 致敏SRBC
(ml) | 结果 | ||
1 | 0.04 | 0.26 | 0.1 | 放
置 37℃水 浴30min | 0.2 | 放
置 37℃水 浴30min | 不溶血 |
2 | 0.06 | 0.24 | 0.1 | 0.2 | 不溶血 | ||
3 | 0.08 | 0.22 | 0.1 | 0.2 | 微溶血 | ||
4 | 0.10 | 0.20 | 0.1 | 0.2 | 微溶血 | ||
5 | 0.12 | 0.18 | 0.1 | 0.2 | 全溶血 | ||
6 | 0.14 | 0.16 | 0.1 | 0.2 | 全溶血 |
(二)血清标本
采集血液标本后及时分离血清,及时检验或将血清保存于-20℃。血清在试验前应先加热56℃30min(或60℃3min)以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一:①加热提高12;②-20℃冻融后离心去沉淀;③以3mmol/L盐酸处理;④加入少量补体后再加热灭活;⑤以白陶土处理;⑥通入CO2;⑦以小白鼠肝粉处理;⑧用含10%新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。
(三)正式试验
以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6逐步加入各种试剂,温育后先观察各类对照管,应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血;抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2U为全溶,1U为全溶略带有少许红细胞,0.5U应不溶。如0.5U补体对照出现全溶表明补体用量过多;如2U对照管不出现溶血,说明补体用量不够,对结果都有影响,应重复进行试验。补体结合试验结果,受检血清不溶血为阳性,溶血为阴性。
表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序
反应物(ml) | 待检血清管 | 阳性对照管 | 阴性对照管 | 抗原对照管 | 补体对照管 | 红细胞对照管 | |||||
测定 | 对照 | 测定 | 对照 | 测定 | 对照 | 2U | 1U | 0.5U | |||
稀释血清 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | - | - | - | - | - |
抗原 | 0.1 | - | 0.1 | - | 0.1 | - | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | - |
缓冲液 | - | 0.1 | - | 0.1 | - | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.4 |
2U补体 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | - | - | - |
1U补体 | - | - | - | - | - | - | - | - | 0.2 | - | - |
0.5U补体 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 0.2 | - |
混匀,置37℃1h或4℃16~18h | |||||||||||
致敏红细胞 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
混匀,置37℃30min后观察结果 |
三、应用和评价
补体结合试验是一种传统的免疫学技术,能够沿用至今说明它本身有一定的优点:①灵敏度高。补体活化过程有放大作用,比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多,能测定0.05μg/ml的抗体,可与间接凝集法的灵敏度相当。②特异性强。各种反应成分事先都经过滴定,选择了最佳比例,出现交叉反应的机率较小,尤其用小量法或微量法时。③应用面广,可用于检测多种类型的抗原或抗体。④易于普及,试验结果显而易见;试验条件要求低,不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。
补体结合试验可应用在以下几方面:①传染病诊断。病原性抗原及相应抗体的检测。②其他抗原的检测。例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、HLA分型等。③自身抗体检测。
但是补体结合试验参与反应的成分多,影响因素复杂,操作步骤繁锁并且要求十分严格,稍有疏忽便会得出不正确的结果,所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。但对于免疫学技术的基本训练仍是一个很好的试验。